邵逸夫医院、浙大一院等 15 家医院联合杰毅生物发表定量宏基因组检测（Q-mNGS）重大研究成果
近日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院、浙江大学医学院附属第一医院等 15 家医院联合杰毅生物开展的，针对肺部感染患者的定量宏基因组检测多中心研究取得重要进展，研究成果正式发表于 《Journal of Infection》（2020 年影响因子 6.072）。论文第一作者为浙江大学附属第一医院呼吸内科周华主任和杰毅生物研发部欧阳川博士，通讯作者为浙江大学医学院附属邵逸夫医院副院长、感染科主任俞云松教授和杰毅生物医学部负责人刘超博士。
研究背景
病原宏基因组检测（mNGS）是基于下一代测序技术（NGS）对标本中的核酸进行无差别的高通量测序，再与微生物基因序列数据库比对分析，实现了非靶向的泛病原体检测，具有灵敏度高、检测周期短、不依赖培养等优点。但由于其无偏倚测序的特性，mNGS 获得的信息中包括标本中的病原体和大量的人源宿主，进而影响了病原体的检测敏感性。尽管去人源/去宿主技术可在一定程度上提高 mNGS 的敏感性，但同样存在非特异性损失病原体的风险。
图 1. 微生物序列数（PCR 建库、PCR-free 建库）与标本人源细胞数量成反比
本研究收集了浙江省 15 家医院 205 名疑似肺炎且排除 RNA 病毒感染的患者入组，每位患者取肺泡灌洗液后分成两份进行检测（一份去人源，一份不去人源）。
肺炎患者 Q-mNGS 检测
研究者设计并测试了 5 种不同长度和核苷酸序列（与任何已知生物的基因组无显著同源性）作为内标分子（spike-in internal control，简称 spike），用来监测标本中人源与微生物核酸的载量。模拟实验显示，spike 序列数与投入量呈正相关，但与人源细胞数呈负相关。
图 2. spike RPM 随标本人源细胞数量的增加而降低
研究者在每个 BALF 标本中加入等量的 spike 1，继而进行 mNGS 测序，并同时采用 AO/PI 双荧光染色法进行有核细胞计数，以评估 spike 序列数与有核细胞计数之间的关联。结果显示， spike 序列数与细胞计数呈负相关，人源指数（H index）与细胞计数呈正相关，人源指数（H index）可以有效反应标本中人源核酸的含量。
图 3. Spike 序列数，人源指数（H index）与有核细胞计数的相关性分析
考虑到人源含量影响 mNGS 检测敏感性，研究者对常规 mNGS（不去人源）和去人源后 mNGS 检测（差异化裂解）进行对比。结果显示，差异化裂解去人源会同时造成某些微生物序列数上升，某些微生物序列数下降，对细菌和分枝杆菌的富集作用较病毒和真菌更明显。94.79% 的标本去人源前后的结果一致，但 8 例（8/205, 3.90%）标本在常规 mNGS 检测时结果为阴性，而在去人源后 mNGS 检测结果为阳性，其中包括 4 例结核分枝杆菌、2 例烟曲霉和 2 例白色念珠菌。去人源后造成损失的病原体主要为耶氏肺孢子菌（2 例，RPM 分别下降 7695.87 和 8397.47）。
图 4. 入组标本的人源指数以及去人源对微生物序列数的影响
研究者对 mNGS 用于感染/非感染性疾病的诊断性能进行了分析，205 例患者中有 15 例（7.32%）为非感染性疾病，190 例为感染性疾病，其中 115 例（60.53%）发现了明确病原学依据。在 115 例患者中，mNGS 的阳性率为 93.04%（107/115），显著高于临床常规检测（细菌、真菌培养，G/GM/GXM 试验，抗酸染色，Xpert 等）的阳性率 49.57%（57/115）。mNGS 共为 123 例患者做出（60.00%）明确诊断，其中 64 例患者，mNGS 结果为唯一诊断依据，显著多于常规检测（8 例）。另外，研究发现 mNGS 阴性结果也有助于临床排除感染，本研究通过 mNGS 明确非感染诊断 14 例（93.3%），包括间质性肺炎 6 例、肺癌 4 例、心脏衰竭 1 例、过敏性肺炎 1 例、慢阻肺（COPD）1 例和放射性肺炎 1 例。
图 5. 入组患者检测结果及临床诊断结果
总结
mNGS 因其无偏倚、非靶向的特性，在鉴定疑难、危重、特殊感染方面相较常规病原学检测方法具有显著优势，但标本中人源含量会影响 mNGS 对于病原体的检测敏感性，而差异化裂解技术在提升微生物检测性能的同时，也会造成一些微生物序列的减少、甚至丢失，因此需要仔细评估和谨慎执行，不建议对所有标本无差别使用。
Q-mNGS 原理解析
mNGS 对于病原体的检测敏感性受标本中人源核酸含量影响，在相同测序数据量下，标本中人源核酸含量越高，mNGS 检测到的人源序列就越多，即检测到的病原体序列就越少，对于病原体的检测敏感性就越差，甚至会导致漏检或假阴性。
Q-mNGS 在对标本进行检测前，在每份标本中加入等量的 spike，并与标本中其他核酸（人源核酸、病原体核酸）一起进行检测，因此以 spike 序列信息作为参照，将人源和病原体核酸进行相对定量，获得标本中真实的人源核酸和病原体核酸含量，以识别高人源下的假阴性和低人源下的真阴性，选择性的对高人源标本进行去人源，提升检测阳性率，同时降低去人源造成的病原体损失，还可以协助临床进行病原体的载量监控和病程管理。
图 6. Q-mNGS 通过 spike 定量人源和病原体核酸
