创新技术引领感染精准诊疗新时代

基于 PCR-free 建库的 mNGS 实验可在同一个空间内设置试剂准备区、标本处理区（配备生物安全柜）和建库测序区（PCR-free 建库、文库纯化、等量混合、上机测序）。PCR-free 文库浓度可能低于 Qubit 荧光定量仪的检测限，建议使用荧光定量 PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法进行文库浓度测定。虽然基于 PCR-free 建库的 mNGS 实验在文库定量前实验操作不存在 PCR 扩增建库所带来的气溶胶风险，但仍然需要警惕人员操作等带来的气溶胶污染可能性，并在一个相对独立的空间进行 qPCR 法文库浓度测定。

（1）湿实验应由具备分子生物学检验专业技能的人员，如分子生物学检验专业检验技师操作；

（2）干实验需要配备生物信息研发及管理人员，以保证分析流程、持续更新、性能确认、维护及管理 ［12］；

（3）结果审核应配备具有临床感染病学相关知识的微生物检验医师。针对疑难报告，建议成立 mNGS 报告解读团队，由具备临床感染病学、临床微生物检验学、临床分子生物学、生物信息学等相关专业知识的人员组成。所有人员均须通过岗位相关的培训和考核，并进行定期能力评估方能上岗。

核酸提取和纯化若使用手工操作，应考虑不同标本类型的差异、不同核酸提取试剂盒的提取效率、纯度以及片段大小等因素；若使用自动化核酸提取仪系统，需要综合考虑检测通量、自动化程度、成本、核酸质量等因素。

（1）临床标本测序数据集：注释充分、特征明确的临床标本测序数据（FASTQ 或其他格式）［32］；

（2）计算机模拟测序数据：利用序列模拟软件模拟生成测序数据集 ［16,33］，要求既要具有与真实测序数据质量相同/相似的技术参数（文库片段长度分布、测序模式、测序错误类型及频率、测序质量值、测序深度等）［16,34］，也要尽可能对临床标本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和试剂背景核酸等进行模拟；

（3）组合数据集：利用序列模拟软件定量模拟一种或多种目标病原体的测序数据，然后将模拟序列添加到目标病原体阴性标本的真实测序数据中，形成接近临床标本的模拟数据集 ［16］。

利用上述数据开展性能确认，确定干实验流程的主要性能指标，包括准确率、精确率、召回率和 F1-Score（即精确度和召回率的调和平均值）等 ［28,35］。如果在比对过程中出现寄生虫的假阳性结果（寄生虫为真核生物，与宿主序列相似度较高，且部分寄生虫基因组数据中存在人源序列的污染），需要考虑设置更高的阳性汇报阈值或者对相应寄生虫的基因组数据进行清洗。常见的寄生虫汇报阈值为与阴性对照相比 RPM 达到 10 倍以上，基因组数据清洗常采用把目标寄生虫基因组单独与人基因组比对并去除高度同源的序列 ［36］。

表 1 模拟参考品示例

注：人源细胞浓度 1×10 5 cells/ml

• 批内精密度：将上述参考品在同一时间内用相同批次试剂完成 3 个全流程重复，分析批次内结果重复性。
• 批间精密度：用不同批次的试剂分别将上述参考品在 3 个工作日内完成各 3 个全流程重复，分析批次间重复性。
• 可接受标准：对阳性标本，分析结果是指通过生信流程得到的检出病原中包括该参考品中的病原体，则记为正确结果，否则为错误结果。结果一致的实验数占全部实验数比例高于 95%，判断为可接受。

• 实验过程：将投入 5~10 倍 LoD 病原体的临床模拟标本，在 4℃、-20℃冰箱分别保存 1、4、7d，在-80℃冰箱分别冻融 1 和 2 次，评估对检测结果的影响。
• 可接受标准：所有重复均检出目标病原体。

• 尽早使用：危急重症感染或局部感染不及时处理则后果严重，恐危及生命时，应在常规病原检测基础上，尽早使用 mNGS 检测辅助明确病原体 ［43,59］；特殊病原体感染，存在群体性感染事件风险，应在开展常规快速检测的同时，尽早使用 mNGS 检测辅助明确病原体。
• 在治疗过程中使用：高度疑似感染性疾病，但传统微生物检测反复阴性且治疗效果不佳时，考虑在完善常规病原学检测的同时或在其基础上开展 mNGS 检测；传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原感染时，考虑在进一步完善更多病原学检测的同时或在其基础上开展 mNGS 检测；特殊患者如免疫抑制、器官移植术后、反复住院、合并基础疾病，疑似继发感染、新发感染时，考虑常规病原学检测的同时或在其基础上开展 mNGS 检测 ［60,61］。
• 择期使用：表现为慢性或局部感染，或慢性疾病不除外感染，在尝试常规病原学检查未能明确致病源或/和规范性经验抗感染治疗无效时，建议在进一步完善常规病原学检测的基础上，与患者充分沟通后择期使用 mNGS 检测辅助明确病原体 ［51］。

法定传染病病原体：包括《传染病防治法》规定的各类传染病病原体。病原体种类应根据国家相关法律法规的修正进行及时调整。其他烈性传染病病原体：建议参考《人间传染的病原微生物目录》中对高致病性病原体的相关定义。

建议根据国家规定和验证需求将标本在有资质的实验室内进行分离培养、特异基因片段检测、特异性抗原抗体检测等方法复核。如没有剩余标本，应在做好生物安全防护的情况下进行临床重新采样，应用传染病诊断标准中规定的实验室诊断技术进行病原检测，基于病原检测结果，结合临床症状、流行病学史，依据现行传染病诊断标准进行诊断。

如患者被诊断为传染病的，按照《传染病防治法》等法律法规规定的流程上报疾控部门，并且对患者、标本等进行规范的处置。应按要求将剩余标本或重新采集标本送上级部门进行确认，并上报患者情况，同时做好必要的患者隔离措施和相关治疗工作。

检出法定传染病及烈性传染病病原，尤其是当检出甲类传染病（鼠疫、霍乱）以及部分传染性较强、危害较大的乙类传染病（如传染性非典型肺炎、脊髓灰质炎、人类高致病性禽流感、炭疽等）病原体，应立即对下机数据的质量，特别是比对到烈性传染病的特异性序列的准确性、读长数、基因组覆盖度等数据进行严格核实，确认可排除背景核酸污染以及特异性序列比对无误的前提下，同时启动标本复核程序。当从标本中检出明确可导致感染且能排除污染、定植微生物和背景核酸时，应报告高度怀疑该病原菌为引起感染的病原菌。患者无菌部位标本如血液和脑脊液标本中检出可疑病原菌，在无其他感染病原证据且能排除污染、定植微生物和背景核酸时，应报告为可疑致病微生物。从开放性腔道如呼吸道或可能存在皮肤定植菌污染部位的标本中检出条件致病微生物时应结合序列数、文库浓度、患者临床病史信息、感染相关指标，会同多学科专家进行讨论明确是否为责任病原体。报告单中应至少包含检出的病原微生物种属名称、唯一比对的读长数、相对丰度和室内质控数据，以及对术语、技术参数和病原微生物的注释。mNGS 报告中的病原体物种名称应标注标准的中英文名称，部分可参考的网站包括细菌网站 https：//lpsn.dsmz.de/和真菌网站 https：//www.mycobank.org 等。

通过耐药/毒力基因预测病原菌对抗菌药物的敏感性以及病原体的致病力，可为临床的抗感染治疗提供参考依据。但需要注意的是，不是所有的耐药/毒力基因存在即表达，可能存在基因型和表型不一致的情况；部分导致耐药/致病的机制尚无法通过检测基因来明确；目前对于耐药/毒力基因的物种归属分析技术尚未完善。因此，应谨慎开展以耐药/毒力基因来预测病原微生物耐药性和致病力。对于实验室可开展常规药敏试验检测病原菌对抗菌药物敏感性结果的药物，不宜以耐药基因结果进行预测，应以表型法药敏试验结果为准。